使用說明 ：

　　一 、 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 （ 測定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）

　　1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

　　2、按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做 3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組 3-6 個(gè)復(fù)孔。

　　3、接種后培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定 OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X 軸） ，OD 值為縱坐標(biāo)（Y 軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。 ）

　　二 、 細(xì)胞活性檢測

　　1、在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100?L/孔） 。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在 37℃,5% CO 2 的條件下） 。

　　2、向每孔加入 10?L CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)） 。

　　3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)。

　　4、用酶標(biāo)儀測定在 450nm 處的吸光度。

　　5、如果暫時(shí)不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10?L 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

　　三 、 細(xì)胞增值- 毒性檢測

　　1、 在 96 孔板中配置 100 ?L 的細(xì)胞懸液。 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí) （在 37 ℃， 5% CO2 的條件下） 。

　　2、 向培養(yǎng)板加入 10?L 不同濃度的待測物質(zhì)。 在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 （例如： 6、 12、 24 或 48 小時(shí)） 。

　　3、向每孔加入 10 ?L CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)） 。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基） ，去掉藥物影響。

　　4、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)。

　　5、用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。

　　6、如果暫時(shí)不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10?L 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

　　活力計(jì)算：.

　　細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

　　A（加藥） ：具有細(xì)胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

　　A（空白） ：具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度

　　A（0 加藥） ：具有細(xì)胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

　　細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力